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    thioredoxin reductase,TrxR

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微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似， 催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。


测定原理：

TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。


自备仪器和用品：

低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。


试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。

粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。


TrxR 测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。
2.试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。
3.空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，160μL试剂一，迅速混匀后于412nm 测定10s和310s吸光度，记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。
4.测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，140μL试剂一，20μ L上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。△A 测定管=A4-A3。
注意：空白管只需测定一次。


TrxR 活性计算公式：

(1).按蛋白浓度计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/mg prot）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T
= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr

(2).按样本质量计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/g）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷W


（3）按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/104cell）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷
T= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷ 细胞数量


（4）按液体体积计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min /mL）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
= 147×（△A 测定管-△A 空白管）
ε：TNB 在412nm处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10 -4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W ： 样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积， 1 mL；T：反应时间（min），5 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下


(1). 按蛋白浓度计算


活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/mg prot）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T

= 294×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/g）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 294×（△A 测定管-△A 空白管）÷W


（3）按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/104cell）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V样÷V 样总)÷
T= 294×（△A 测定管-△A 空白管）÷ 细胞数量


（4）按液体体积计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min/mL）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
= 294×（△A 测定管-△A 空白管）
ε：TNB 在412nm处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μ mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V 样总： 提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），5 min。


注意事项：

1. 测定前须先取 1～2 个样做预实验，使得吸光值在 5min 内程线性变化。哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右；测定过程操作须迅速。
2. 试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。

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