犬冠状病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品及特点：
犬冠状病毒(Canine Corona Virus，CCoV )为单链 RNA 病毒，有 6-7 种多肽，其中 4 种是糖肽，不含 RNA 聚合酶及神经氨酸酶。可使犬发生程度不同的胃肠炎症状，特征有频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状。本病一年四季均可发生，以冬季多发，病犬是主要的传染原，犬可通过呼吸道、消化道、粪便及污染物传染。该病一但发生，同窝犬同室犬很难控制均可造成感染。幼犬死亡率较高,对幼犬的危害较大。最近的研究发现 CCoV 感染的宿主范围有不断扩大的趋势,许多野生动物如虎、狮、大熊猫、小熊猫、水紹也可感染。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测犬冠状病毒的试剂盒，
它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据犬冠状病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	探针法 qRT-PCR 缓冲液	500 μL（蓝盖）
试剂二	探针法 qRT-PCR 酶混合液	100 μL（红盖）
试剂三	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂四	犬冠状病毒探针法qRT-PCR引物混合液	100 μL（白盖）
试剂五	犬冠状病毒 qRT-PCR 探针	50 μL（棕色管）
试剂六	犬冠状病毒探针法qRT-PCR阳性对照(1×10E8 /μL)	50 μL（黄盖）
使用手册		1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂： 
样品 RNA。
使用方法：
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）：
二、由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备：
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：

成份	样品管 N+2个	RT-PCR阴性对照管	标准曲线样品管 (2-7管)
探针法 qRT-PCR 缓冲液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探针法 qRT-PCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
犬冠状病毒 qRT-PCR 探针	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
犬冠状病毒探针qRT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超纯水	--	5 μL	--
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号）	不加	不加	各5 μL (2号样到2号管，3号样到3号管)

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR： 

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30 min
预变性	94℃	10 min
qRT-PCR反应35个循环	94℃	15 sec
	60℃	1 min，(采集FAM通道的荧光信号)

四、数据处理：
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。