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  • 犬补体成分3a(C3a)ELISA试剂盒

  • Canine C3a ELISA KIT

    Canine / 犬

    6个月

    仅供科研使用

    1.57ng/mL

    3.13 ~ 200ng/mL

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犬补体成分3a(C3a)ELISA试剂盒

产品仅供教研使用，用于定量检测细胞培养上清、血清、血浆中 犬C3a。

简介

补体片断3a(C3a)是由补体成分3裂解形成的蛋白质之一；另一个是C3b；C3a是一种有77个残基的无源性毒素，与C3a受体（C3aR）结合，是一种A类G蛋白偶联受体；它在免疫反应中起着很大的作用；C3a分子通过GPCRC3a受体诱导反应；与其他无精蛋白一样，C3a通过裂解其羧基末端的精氨酸来调节，从而产生一个具有较低炎症功能的分子（C3a去精氨酸）；它是补体系统的效应物，具有一系列功能，包括T细胞的激活和存活，刺激血管生成，趋化作用，肥大细胞脱颗粒和巨噬细胞激活；它已被证明具有促炎症和抗炎症反应，其活性能够抵消C5a的促炎症作用。
检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物C3a，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中C3a的浓度。

操作要点及注意事项
1. 混合蛋白质溶液时，应始终避免起泡。为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。此外，每种试剂应单独使用容器。
2. 确保试剂不间断地添加到板孔中。为了确保准确的结果，在孵育步骤中需要粘合好封板膜。
3. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。
显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。显色剂应从无色变为蓝色。
4. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表示终止液未与基质溶液充分混合。
5. 此试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。
6. 该试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。
7. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

8. 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品。处理后彻底洗手。

试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。洗涤液/稀释液配置：如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置：试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从4μg/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至200ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的200ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将200ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为： 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.13ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。




抗体工作液配置 : 使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。

酶结合物工作液配置 : 使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。

备 注：如待测样本中C3a浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。

结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。
若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

标准品浓度(ng/mL)

200

100

50

25

12.5

6.25

3.13

0

OD值

2.529

1.688

1.085

0.696

0.415

0.283

0.123

0.069

校正OD值

2.460

1.619

1.016

0.627

0.346

0.214

0.054

0


本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果。

实验步骤

所有标准品、样品建议复孔检测
1. 酶标板准备：确定试验所需要的孔数，取下未使用的酶标条放回装有干燥剂的铝箔袋。
2. 样本孵育：每孔分别加入100μL不同浓度的标准品以及预处理过的待测样品（建议样本用通用稀释液最少稀释1倍上样，目的是减少基质效应），盖上封板胶纸，37℃避光反应1 h。孵育结束后，每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液，轻轻晃动30秒，甩干并在纸上拍干，以这种方式清洗3次。
3. 抗体孵育：每孔加入100μL生物素化抗体工作液，轻轻混匀，盖上封板胶纸，37℃避光反应1h。孵育结束后，重复步骤2中的清洗方式清洗4次。
4. 酶标孵育：每孔加入100μL 1×SA-HRP工作液，盖上封板胶纸，37℃避光反应30分钟，清洗4次，拍干。
5. 底物显色：每孔首先加入50μL显色液A，随后加入50μL显色液B，轻轻混匀，盖上封板胶纸，37℃避光反应15分钟。

6. 终止反应：待显色反应结束后，每孔加入50μL终止液，轻轻混匀，5分钟内用预热完成的酶标仪在450nm处测吸光值。

回收率

回收率在不同基质的整个测定范围内选取在健康 犬血清、血浆和细胞培养上清中加入3个不同浓度水平计算回收率。

线性关系
分别在选取的4份健康 犬血清、血浆和细胞培养上清中加入高浓度C3a，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。

注意事项
本公司 犬ELISA试剂盒检测范围、灵敏度等实验数据，因检测样本的不同会有所调整，实际数据以随货说明书为准。

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