苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)联合染色简称HE染色,是病理学和组织学最常用的一种染色方法。苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的主要成分是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。
Heidenhain铁苏木素染色液以硫酸铁铵作为氧化剂和分化剂,根据不同的分化程度可显示不同的结构。染色后所有成分均为黑色或深灰黑色,不同组织结构的苏木素着色可被Heidenhain分化液以不同的速度进行性褪去,黑色褪去顺序依次为:线粒体、横纹肌、核染色质。
染色原理:
细胞核染色的原理:
苏木素为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木素在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。
细胞浆染色的原理:
伊红是一种化学合成的酸性染料,在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质,为两性化合物,细胞浆的染色与染液的pH值密切相关。当染色液pH值在胞浆蛋白质等电点(4.7~5.0)以下时,胞浆蛋白质以碱式电离,则细胞浆带正电荷,就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子,与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合,使细胞浆着色,呈现红色。
分化作用:
染色后,用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去,这个过程称为分化作用,所用的溶液称为分化液。在HE染色中常用1%盐酸乙醇作为分化液,因酸能破坏苏木素的醌型结构,使组织与色素分离而退色。大多数组织经苏木素染色后,必须用1%盐酸乙醇分化,使细胞核过多结合的苏木素染料和细胞浆吸附的苏木素染料脱去,再进行伊红染色,才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。
返蓝作用:
分化之后,苏木素在酸性条件下处于红色离子状态,呈红色;在碱性条件下处于蓝色离子状态,呈蓝色。组织切片经酸性乙醇分化后呈红色或粉红色,立即用水除去组织切片上的酸而中止分化,再用弱碱性水使苏木素染上的细胞核呈现蓝色,这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。
注意事项:
1、 Heidenhain Differentiation媒染时间和Heidenhain铁苏木素染色液染色时间根据不同的固定液而异。一般情况下,媒染和染色时间控制在1h即可,参考时间为:福尔马林、Bouin固定液、Carnoy固定液1h,Helly、Zenker等重铬酸盐固定液3h,四氧化锇、Flemming固定液24h。
2、 显微镜下控制分化程度,直到出现所需观察的结构。若分化过度,可用苏木素重染相同时间并重新分化。亦可用蒸馏水2:1稀释Heidenhain Differentiation后再进行分化,以便更好控制分化程度。
3、 切片分化后应彻底冲洗洗掉所有分化液,组织不易褪色。
4、 胞浆复染(伊红或橙黄G)可突出核染色质,尤其在显示染色体或有丝分裂更有效。
5、 切片脱蜡应尽量干净。
6、 系列乙醇应经常更换新液。
7、 冷冻切片染色时间尽量要短。
8、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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