钙在人体内大量存在,构成骨骼作为支持人体的支架,在分泌、运送、肌肉收缩、神经传导等也起重要作用。钙在机体内以两种形式存在,一种是离子钙,存在血液循环内,即所谓血钙;另一种是结合钙,和蛋白、碳酸或磷酸结合而沉着在组织内。除骨骼和牙齿外,正常时钙渗透在所有组织和细胞中,一般不以固体状态出现在组织内。但在某些情况下,钙析出成固体并沉着于组织内,则为病理性钙盐沉着。沉着的钙盐主要是磷酸钙,其次为碳酸钙。钙盐通常是单折射的,但草酸钙是双折射的。当使用HE染色时,钙一般呈紫蓝色。许多染料可以于钙形成螯合物,包括茜素红S、红紫素、核固红等。茜素红S属一种蒽醌类衍生物,是茜素磺酸钠盐,它能与碳酸钙或磷酸钙中的钙盐螯合形成橙红色复合物。
钙盐染色常用方法有Von Kossa-Ag法和茜素红S法, 钙盐染色液采用Von Kossa-Ag法,其原理在于该法是一种金属置换法,银溶液作用于含有不溶性钙盐的切片时,钙被银所置换,银盐在光的作用下被还原为黑色金属银,适用于大量样本的钙盐组织染色。
自备材料:
1、 10%中性福尔马林固定液
2、 系列乙醇
3、蒸馏水
4、显微镜
操作步骤(仅供参考):
组织固定于10%中性福尔马林,常规脱水包埋。
切片厚度5μm,常规脱蜡至水。
蒸馏水洗1min。
切片入Von Kossa银溶液,强光照射15~60min(见注意事项2)。
蒸馏水洗1min。
入海波溶液处理2min。
HE染色液或Van Gieson复染细胞核。
常规脱水透明,中性树胶封固。
阴性对照:
1、如有必要,可做阴性对照。取另外一张连续切片脱蜡至水,置于Von Kossa对照液处理20min,流水冲洗5min。与试验片一同入Von Kossa银溶液,余下步骤同上,结果为阴性。
注意事项:
钙盐组织固定以中性福尔马林为佳,不宜采用Bouin液等酸性固定液和甲醛钙固定液。如用常规的10%福尔马林固定,固定4~6h后即可进行脱水包埋,以防止固定液酸化导致钙盐溶解。
作用时间取决于阳光照射时光的强度和时间。如暴露于强光下,15min已经足够;如暴露于紫外灯下,10min即可;如暴露于一般光线下,宜适当延长曝光时间。
该染色法可以区分尿酸盐和钙盐,其原理在于钙盐不溶解于碳酸锂溶液,尿酸盐易溶解于碳酸锂溶液,切片经碳酸锂处理后,入银溶液并置于强光下,尿酸盐呈阴性反应。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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