草酸铵结晶紫染色液是革兰氏染色法中的一种成分,主要由草酸铵、结晶紫、乙醇等组成。革兰阳性菌染色中,细胞经草酸铵结晶紫染色后再经Gram碘液处理,形成不溶性复合物,该复合物不能通过细胞壁,不易被脱色,所以保持紫色。染色后细菌与环境形成鲜明对比,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,而用以分类鉴定。
自备材料:
1、 接种环或挑取细菌的其他工具。
2、 酒精灯
3、 载玻片
4、 光学显微镜
操作步骤(仅供参考):
1、 按实验具体要求操作或参考下列革兰氏染色的方法。
2、 涂片:取待检细菌,于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水,取菌与的水混合均匀,涂成一薄层。
3、 干燥:涂片后在室温下自然干燥,也可在酒精灯上略加温,使之迅速干燥。
4、 固定:手持载玻片一端,标本面朝上,在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次,每次1s,温度不宜过高,防止菌体蛋白变性,放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。
5、 初染:滴加结晶紫染色液染色1~2min,清水冲洗去染色液。
6、 媒染:滴加Gram碘液,并覆盖载玻片,室温放置1~2min,水洗。
7、 脱色:滴加脱色液,摇动10~30s,直至流下的脱色液不出现紫色时为止,立即用水冲去脱色液,终止反应。
8、 复染:滴加沙黄染色液染色30~60s,水洗。
9、 干燥。镜检:置油镜观察。
注意事项:
1、 涂片之前,应事先在背面做好圆圈标记,以便判断后续试验的位置。
2、 取细菌时,应注意自我防护,拔或塞试管塞时,应将试管口通过火焰略加烧灼,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
3、 加热固定涂片时,应注意玻片勿太靠近火焰,一般要求玻片温度不超过60℃,以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。
4、 革兰氏染色的关键在于严格掌握脱色程度,脱色时间应根据经验判断。脱色过度,阳性菌可被误染为阴性菌;脱色不够,阴性菌可被误染为阳性菌。
5、 待检细菌培养时间会影响染色,阳性菌培养时间过长或已死亡或细菌溶解,常呈阴性。
6、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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