负染色又称阴性染色,是由Hall发现的相对于普通染色(即正染色)而言的染色技术。其原理在于利用重金属盐包绕低电子密度的样品,增强样本四周的电子密度,造成细微结构之间的"质量-厚度”差异,增强散射吸收反差,使样品在黑暗的背景上呈现明亮的结构。负染色液有磷钨酸、钼酸铵、印度墨汁等,其中最常用的是1~3%磷钨酸。
磷钨酸负染色液(5%)适用于显示大分子、细菌、病毒、原生动物、噬菌体、细胞器、核酸大分子、蛋白质晶体及其他大分子材料等,尤其适用于较难染色的样本。染色后的样品图像呈现透明的亮光,而背景图像呈黑色。
自备材料:
1、 离心机
2、 载网
3、 显微镜
操作步骤(仅供参考):
(一)滴染法
1、样品低速离心(2000g,10min)或采用其他方法浓缩样品,制成悬浮液并且使其达到一定浓度和纯度。
2、将样品悬浮液直接滴于带有支持膜的载网上,静置3~5min。
3、用滤纸条从液滴边缘吸去多余液体,稍干燥。
4、 滴加负染色液,静置2~3min。
5、吸去多余染色液,自然干燥,进行显微镜观察。
(二)漂浮法
1、样品低速离心(2000g,10min)或采用其他方法浓缩样品,制成悬浮液并且使其达到一定浓度和纯度。
2、将带有支持膜的载网置于样品液滴上漂浮以沾取样品。
3、载网置于负染色液上漂浮1~2min。
4、吸去多余染色液,自然干燥,进行显微镜观察。
注意事项:
目的样本尽量新鲜。
样品应为均匀的悬浮液,其纯度和浓度应适宜,否则无法与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。
对于大多数样品的负染,2~3%磷钨酸已经足够,5%磷钨酸可用于较难染色的样本。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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